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前言

錯(cuò)配修復(fù)缺陷（dMMR）指四種錯(cuò)配修復(fù)（MMR）蛋白中至少一種表達(dá)缺失，主要由三種原因?qū)е拢篗MR基因胚系突變、體系突變，以及MLH1基因啟動(dòng)子區(qū)高度甲基化。林奇綜合征（Lynch syndrome，LS）又稱遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC），是一種常染色體顯性遺傳病，通常由MMR基因胚系突變引起。與MMR基因突變相比，MLH1甲基化導(dǎo)致的MLH1蛋白缺失更為常見。多個(gè)指南共同推薦，在結(jié)直腸癌（CRC）和子宮內(nèi)膜癌（EC）中，異常的MLH1免疫組織化學(xué)（IHC）結(jié)果應(yīng)進(jìn)行MMR基因胚系檢測(cè)或腫瘤組織MLH1甲基化檢測(cè)，甲基化提示散發(fā)性腫瘤^[1-3]。

CRC林奇綜合征篩查流程^[2]

組成性表觀突變

上述篩查流程采用MLH1基因甲基化檢測(cè)，將散發(fā)病例排除在MMR基因胚系檢測(cè)之外。雖然可以降低篩查成本，提高患者的依從性，但是忽略了組成性MLH1基因表觀突變/甲基化（constitutional MLH1 epimutation/ methylation，也有翻譯成結(jié)構(gòu)性/體質(zhì)性MLH1表突變）這樣的罕見病例。組成性表觀突變的特征是正常組織中單個(gè)等位基因的啟動(dòng)子甲基化和轉(zhuǎn)錄失活，外周血淋巴細(xì)胞（PBL，中胚層）、正常結(jié)腸粘膜（內(nèi)胚層）、肌肉（中胚層）、口腔粘膜（外胚層）樣本中均可能檢測(cè)到^[4]。組成性表觀突變分為原發(fā)性和繼發(fā)性，原發(fā)性表觀突變沒有明顯的連鎖序列變化，在減數(shù)分裂過程中是可逆的，偶爾以非孟德爾模式傳遞給下一代，很少與明確的癌癥家族史相關(guān)；繼發(fā)性表觀突變由DNA序列改變的順式作用引起，遵循孟德爾遺傳模式傳遞^[4-7]。組成性表觀突變可能是嵌合性的，甲基化水平在不同等位基因和組織中具有異質(zhì)性^[4-5]。

MLH1和MSH2基因的組成性表觀突變已被確定為L(zhǎng)S的罕見病因。MSH2表觀突變是典型的繼發(fā)性表觀突變，是位于MSH2上游17 kb的EPCAM基因3’端胚系缺失的結(jié)果^[6]。組成性MLH1表觀突變的分子機(jī)制較為復(fù)雜，發(fā)生在2-3%的突變陰性的疑似林奇家系中^[7]。組成性甲基化病例表現(xiàn)為與MLH1-LS一致的早發(fā)性和/或多發(fā)性原發(fā)腫瘤；也會(huì)導(dǎo)致腫瘤出現(xiàn)MLH1缺失、MSI-H和MLH1甲基化，這些特征與常見的散發(fā)病例重疊^[8]。

MLH1表觀突變隊(duì)列研究^[8]

美國(guó)俄亥俄州的一項(xiàng)回顧性研究納入了Columbus（n=1566）和OCCPI（n=3310）兩個(gè)CRC隊(duì)列，入組標(biāo)準(zhǔn)為（1）MLH1缺失和/或MSI-H，（2）MLH1甲基化，（3）PBL DNA或全血DNA的可用性。使用焦磷酸測(cè)序和甲基化特異性多重?zé)晒釶CR（MS-qPCR）兩種檢測(cè)方法分析血液DNA樣本，任一檢測(cè)產(chǎn)生的信號(hào)高于檢測(cè)限，既認(rèn)為樣本甲基化陽(yáng)性。

在Columbus隊(duì)列中，95例甲基化檢測(cè)成功，焦磷酸測(cè)序與MS-qPCR結(jié)果完全一致。有4例（4.2%）檢測(cè)到組成性MLH1甲基化，診斷時(shí)年齡分別為34、36、52和74歲，患者均首發(fā)CRC，只有一例（Columbus-65）有家族史記錄?；颊逤olumbus-6大約一半的等位基因甲基化，其他3名患者的甲基化水平較低，提示嵌合性甲基化。

兩個(gè)隊(duì)列血液樣本中檢測(cè)到的甲基化

在OCCPI隊(duì)列中，281例甲基化檢測(cè)成功，焦磷酸測(cè)序與MS-qPCR結(jié)果完全一致。有4例（1.4%）檢測(cè)到組成性MLH1甲基化，年齡分別為20、34、50和55歲，患者均首發(fā)CRC，均有不明確的家族史。3例患者約一半的等位基因甲基化，OCCPI-1血液中具有低水平（4.2%）嵌合甲基化，啟動(dòng)子區(qū)c.-93G＞A雜合。取其腫瘤和配對(duì)正常結(jié)直腸粘膜（NCM）檢測(cè)，NCM檢測(cè)到類似的低水平（2.6%）嵌合MLH1甲基化，在腫瘤中檢測(cè)到高水平（60.8%）甲基化。MLH1啟動(dòng)子測(cè)序顯示腫瘤中c.-93G＞A處未甲基化“A”等位基因的雜合性丟失（LOH），作為腫瘤發(fā)生的“二次打擊”。

OCCPI-1患者NCM和腫瘤檢測(cè)結(jié)果

年齡分層顯示年輕患者的組成性MLH1甲基化率高。在Columbus和OCCPI隊(duì)列中，以年齡≤55歲為界，組成性甲基化率分別為75%（3/4）和23.5%（4/17），可以檢測(cè)到大多數(shù)病例。雖然數(shù)據(jù)不全，但是4例具有BRAF V600E腫瘤檢測(cè)結(jié)果的組成性甲基化患者均為BRAF野生型。與之前的報(bào)道一致，組成性甲基化患者BRAF野生型的頻率更高。如果使用BRAF V600E檢測(cè)代替MLH1甲基化作為MLH1缺失患者的篩查，組成性MLH1甲基化患者會(huì)進(jìn)一步接受MMR基因胚系檢測(cè)，并可能產(chǎn)生陰性/無(wú)臨床意義的檢測(cè)結(jié)果。

Columbus和OCCPI隊(duì)列中按年齡劃分的組成性MLH1甲基化檢出率

代表性研究

除了上述NCCN指南引用的隊(duì)列研究以外，之前亦有一些關(guān)于組成性MLH1表觀突變的研究或案例報(bào)道，包括原發(fā)性和繼發(fā)性表觀突變。我們從中挑選幾個(gè)代表性研究。

研究一^[6]：

法國(guó)的一項(xiàng)研究結(jié)合大片段PCR和高通量測(cè)序（NGS）的方法，研究了4個(gè)具有遺傳性表觀突變的家系和10例沒有證實(shí)表觀突變的患者。家系1檢出MLH1 1號(hào)外顯子3‘末端上游6 bp處AluYc序列的插入，長(zhǎng)度為345個(gè)核苷酸。這種插入會(huì)導(dǎo)致MLH1基因的破壞，提供一個(gè)新的剪接供體位點(diǎn)，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本編碼截短蛋白。帶有Alu插入的等位基因在家系中與甲基化共分離。

家系1顯示組成性MLH1表觀突變的常染色體顯性遺傳，和插入AluYc序列的1號(hào)外顯子序列

家系2的先證者為CRC，一級(jí)親屬?zèng)]有癌癥病史，表現(xiàn)出MSI-H和PMS2孤立的蛋白表達(dá)缺失，但PMS2基因測(cè)序未發(fā)現(xiàn)突變。在患者腫瘤和PBL DNA中檢測(cè)到MLH1啟動(dòng)子甲基化，并在6名無(wú)癥狀親屬中鑒定出表觀突變。使用多重連接探擴(kuò)增（MLPA）和比較基因組雜交陣列（CGH-array）發(fā)現(xiàn)包含EPM2AIP1 基因和 MLH1 1-6號(hào)外顯子的大片段重復(fù)，重復(fù)片段大小約29.54 kb，片段兩端位于Alu元件中，與甲基化共分離。

家系2顯示組成性MLH1表觀突變的常染色體顯性遺傳，以及包含 EPM2AIP1 和 MLH1 1-6號(hào)外顯子的重復(fù)

在家系3中檢出MLH1 1號(hào)內(nèi)含子上的新發(fā)突變c.116+106G＞A，該突變?cè)诩蚁抵信c甲基化共分離。在10例沒有證實(shí)表觀突變的患者中，有一例（P4）也是該突變的攜帶者，但其患病和未患病的家屬均未檢出表觀突變或c.116+106G＞A突變。家系4檢出MLH1 c.27G＞A同義突變，該突變?cè)谥暗慕Y(jié)腸癌家庭登記（C-CFR）多中心研究中已有報(bào)道^[5]。在一例未證實(shí)患者（P5）中也檢出該突變，但單倍型與家系4不同。此外，研究還在一例未證實(shí)患者（P3）中檢出MLH1 5’UTR區(qū)的c.-167delA突變，與甲基化相關(guān)。

研究也證實(shí)了基因沉默先于DNA甲基化，表達(dá)程度較低的等位基因更容易甲基化的理論。有些突變本身導(dǎo)致等位基因完全失活，與表觀遺傳沉默無(wú)關(guān)，啟動(dòng)子甲基化可能作為失活的冗余機(jī)制出現(xiàn)。甲基化可以作為轉(zhuǎn)錄沉默的穩(wěn)定機(jī)制，阻止細(xì)胞轉(zhuǎn)錄無(wú)功能的等位基因。此外，一些已經(jīng)驗(yàn)證了對(duì)剪接功能有影響的突變沒有相關(guān)的啟動(dòng)子高度甲基化，這可能與序列改變影響與表觀遺傳修飾元件的結(jié)合有關(guān)。

研究二^[9]：

意大利的一項(xiàng)研究采用NGS和MS-MLPA等技術(shù)研究了56例患者的61個(gè)MLH1缺失腫瘤（CRC的BRAF均為野生型），有4個(gè)腫瘤樣本的甲基化水平非常高（大于0.9），4例患者的血液DNA均鑒定出組成性MLH1甲基化。

在家系F-5中，兩位成員P-09和P-10均攜帶MLH1 c.-168_c.116+713del胚系缺失，其罹患的三種腫瘤（2個(gè)CRC和1個(gè)EC）具有相同的體細(xì)胞甲基化模式。兩位患者均為組成性MLH1甲基化攜帶者，證明MLH1啟動(dòng)子區(qū)的大片段缺失會(huì)導(dǎo)致該基因的表觀遺傳沉默，并被定義為繼發(fā)性表觀突變。

繼發(fā)性表觀突變家系F-5

在家系F-6中，P-38是一名年輕女性CRC患者，攜帶PMS2 P794S胚系臨床意義未明（VUS）突變，組織中檢測(cè)到高水平的MLH1甲基化，血液中亦檢測(cè)到甲基化。研究者將這種情況定義為MLH1原發(fā)性表觀突變。三年后，這位患者患上了MLH1缺陷的復(fù)雜子宮內(nèi)膜增生。

 原發(fā)性表觀突變家系F-6和患者P-38檢測(cè)結(jié)果

指南推薦

NCCN遺傳性/家族性高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌指南對(duì)于組成性MLH1表觀突變的檢測(cè)，做了如下推薦^[1]：

• 患者的組成性MLH1表觀突變是一個(gè)罕見的例外。對(duì)于早發(fā)性CRC（≤55歲）、無(wú)BRAF V600E突變、IHC中MLH1缺失、無(wú)胚系MLH1致病/疑似致病突變或任何年齡MLH1啟動(dòng)子高度甲基化的>1個(gè)腫瘤患者，考慮轉(zhuǎn)診到具有基因檢測(cè)專業(yè)知識(shí)的機(jī)構(gòu)進(jìn)行MLH1甲基化檢測(cè)。

• 評(píng)估組成MLH1表觀突變采用血液或其他正常組織樣本檢測(cè)MLH1啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。

總結(jié)

組成性MLH1甲基化是疑似LS腫瘤不可忽視的機(jī)制之一，在MLH1缺失且未發(fā)現(xiàn)MMR序列突變的患者中有一定的發(fā)生頻率，Columbus隊(duì)列為4.2%，OCCPI隊(duì)列為1.4%^[8]，C-CFR研究為3.8%（16/416）^[4]。但是就總體而言，組成性MLH1甲基化在未經(jīng)選擇的CRC中極為罕見，Columbus隊(duì)列為0.26（4/1566），OCCPI隊(duì)列為0.12%（4/3310）^[8]，其并不影響各指南對(duì)于MLH1甲基化提示散發(fā)性腫瘤可能性較大的推薦。

對(duì)于MLH1蛋白表達(dá)缺失的CRC和EC，MLH1基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)有助于明確腫瘤的MMR、MSI狀態(tài)，排除林奇綜合征的風(fēng)險(xiǎn)。此外，MLH1甲基化亦可提示EC的預(yù)后，輔助治療方案的選擇^[10-11]，并且對(duì)分子分型也具有補(bǔ)充提示的作用^[12]。飛朔生物的MLH1基因甲基化檢測(cè)試劑盒采用MS-qPCR技術(shù), 轉(zhuǎn)化后僅需一步操作，可檢出甲基化頻率低至1%的樣本。飛朔致力于為腫瘤個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)檢測(cè)提供最具創(chuàng)新性的產(chǎn)品和服務(wù)，并持續(xù)更新現(xiàn)有產(chǎn)品。

參考文獻(xiàn)

[1] NCCN遺傳性/家族性高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌2024 v3

[2] CSCO結(jié)直腸癌診療指南2024

[3] CSCO子宮內(nèi)膜癌診療指南2024

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[11] Cancer. 2022 Mar 15;128(6):1206-1218.

[12] 中華婦產(chǎn)科雜志2023年10月第58卷第10期